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分子擴增不僅僅有“PCR”,恒溫擴增“MIRA”來了

  分子診斷技術今日不同以往,近兩年確實在突飛猛進,期間恒溫擴增技術由于其擴增期間不需要特殊儀器設備而更受矚目。眾所周知的恒溫擴增方法有多種,例如,LAMP;RPA;RAA等。但是,今天我再給大家介紹一款更新的恒溫擴增技術“MIRA”。

  為了確保大家所認知的基本概念是一致的,請先了解以下名詞解釋

  · 重組酶聚合酶擴增技術,RPA:recombinase polymerase amplification

   · 重組酶介導的擴增技術,RAA:recombinase-aidamplification

   · 環介導等溫擴增技術,LAMP:Loop-mediated isothermal amplification

  · 多酶恒溫快速擴增技術,MIRA:Multienzyme Isothermal Rapid Amplification

         小結解惑:

大家一定很疑惑,上述這么多種等溫或恒溫擴增技術。那么,哪種技術更加可靠和穩定呢?事實上任何技術都有它的優點和確定。但是,最終能否推廣起來,還要看它的能否穩定量產,成本低廉以及“皮糙肉厚”(通用&適用性強)。

對此,小編就自己所知的,簡單和大家分析一下。

      環介導等溫擴增LAMP:

      很多同道都知道LAMP起源于日本,是日本學者Notomi于2000年公布的一種新型基因診斷擴增技術,F下其技術所有權屬于日本榮研化學株式會社(以下簡稱“榮研公司”)。

優點:靈敏度高(比傳統的PCR方法高2~5個數量級);反應時間短(30~60分鐘就能完成反應);臨床使用不需要特殊的儀器(試劑盒研發階段推薦用實時濁度儀);操作簡單(不論是DNA還是RNA,檢測步驟都是需將反應液、酶和模板混合于反應管中,置于水浴鍋或恒溫箱中63℃左右保溫30~60分鐘,肉眼觀察結果)。

缺點:靈敏度高,一旦開蓋容易形成氣溶膠污染,無法脫離PCR實驗室,否則假陽性問題比較嚴重。強烈推薦在進行試劑盒的研發過程中采用實時濁度儀,不要把反應后的反應管打開;引物設計要求比較高,有些疾病的基因(特別是共性序列較少/短的病毒類)不適合使用環介導等溫擴增方法。應用領域相對比較窄。

     RPA和RAA恒溫擴增技術:

     上述兩種技術基本同源,除了其使用的重組酶的來源不同以外,其工作原理基本相同。

· RPA的重組酶來源于T4噬菌體;

· RAA的重組酶來源于細菌或者真菌。

     工作原理要點:

     1、在ATP存在條件下,重組酶與引物結合, 形成蛋白-核酸聚合體,并搜索配對目標;

     2、當引物尋找到配對DNA模板,ATP水解供應能量,重組酶離開引物,并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA鏈;

     3、同時,單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNA binding, SSB)同被置換出來的DNA單鏈進行結合,防止DNA模板再次形成雙鏈。

圖片1.jpg 

RPA工作原理圖

優點:RPA/RAA整個反應非常迅速,約30min就可以得到結果;靈敏度可達10copies/ul;擴增期間不需要復雜的儀器;在此基礎上開發的探針法或膠體金層析法都大大簡化了檢測結果的使用儀器,可以更好的滿足不具備分子檢測條件的基層或者經濟較為落后的地區。

缺點:RPA是英國TwistDx公司開發的技術,現技術所有權為美國雅培(Abbott)故,成本極高,供貨周期長,沒有技術支持。很難實現國內大面積應用和量產;

RAA純國產技術。但是在抗干擾和成品試劑穩定性上還不是很穩定。此外,功能酶的制造工藝還有待完善,雖然推出市場已經有5年之久,但是由于穩定性和多元性的問題,尚未推廣開來。

此外,RPA和RAA的擴增引物長度均要求30-35bp,太短引物會影響特異性、靈敏度和擴增速度。故設計引物有難度。

 

      MIRA恒溫擴增技術:

      2019年中才出現的全新的常溫恒溫擴增技術。RPA和RAA的同源技術。

      雖然,MIRA技術和前面的RPA和RAA屬于同源技術,工作原理相近。但是在酶的選種和培養、純化等一系列的量產工藝方面和上述兩種技術有很大區別。此外,作為MIRA技術的開發者“安普未來公司”技術團隊在該技術上的沉淀已接近11年。已可完全應對成品試劑開發、訂制開發、科研課題結題以及液體試劑等各類多元化的訂制服務。

圖片2.jpg 

     優點:

     1、MIRA試劑中的功能蛋白篩選了來源不同的各種酶,并且對某些酶進行了定點改造與修飾,使其核心功能酶體系效率更高同時體系更加完整。

     2、抗干擾能力和穩定性。MIRA試劑對整個體系與輔因子的種類與濃度進行了一系列的篩選和凍干生產工藝上多方面優化,使其抗干擾能力與穩定性更強;

     3、多樣化和個性化。得益于所有的功能蛋白自主生產和對該技術理論的深入了解,可以使mira技術在應用上實現多樣化?梢蕴峁┎煌w系的試劑等,還可以根據客戶的需求實現個性化的定制服務。

     4.具有自主專利,不擔心在后期成品研發中觸及專利違規情況。100%國產技術,在今后國內乃至國際市場的競爭中具有顯著優勢。

     5. 已建立完整的生產Protocol?梢苑定的大批量生產。

    缺點:

    1. 市場認知度還比較低,需要進一步積累在各個領域的數據和參考文獻等。例如,不同領域的陽性率等參考數據。

    2. 引物設計上延續了RPA或RAA等技術的特點,需要較長的引物序列或探針序列。不太利于當下PCR用戶的快速切換。


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