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分子診斷技術全解析

时间:2021-07-03     【转载】   来自:小桔燈

分子診斷技術是用分子生物學方法針對人體及各種病原體的遺傳物質的表達及結構進行檢測,從而達到預測及診斷疾病的目的。

近年來,隨著分子診斷技術的升級迭代,分子診斷的臨床應用越來越廣泛和深入,分子診斷市場進入快速發展期。

筆者總結市場上常見的分子診斷技術,分為上中下三篇,上篇介紹PCR技術,中篇介紹核酸等溫擴增技術,下篇介紹測序技術。

     上篇:PCR技術

PCR技術

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應,是體外DNA擴增技術之一,至今已經超過30年的歷史。

PCR技術于1983年由美國Cetus公司的KaryMullis首創,1985 年Mullis申請了PCR專利,同年在Science上發表了第一篇PCR 學術論文,1993 年Mullis因此獲得了諾貝爾化學獎。

PCR基本原理

PCR可以將目標DNA片段擴增一百萬倍以上,其原理是在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。

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標準 PCR 過程分為三步

1.變性(Denaturation):利用高溫使DNA 雙鏈分離。DNA雙鏈之間的氫鍵在高溫下(93- 98℃)被打斷。

2.退火(Annealing):在 DNA 雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA 上。

3.延伸(Extension):DNA 聚合酶由降溫時結合上的引物處開始沿著DNA 鏈合成互補鏈,延伸完成,則完成一輪循環,DNA片段數增加一倍。

往復循環這三個步驟25-35 次,DNA 片段數將得到指數級增加。

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PCR的巧妙之處在于針對不同的目標基因可以設計不同的引物,使目標基因片段在短時間內得到百萬級的放大。

目前為止,PCR可以分為三類,分別是普通PCR、熒光定量PCR和數字PCR。

第一代普通PCR

采用普通PCR 擴增儀來對靶基因進行擴增,然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測,只能做定性分析。

第一代PCR主要缺點:

1.容易發生非特異性擴增和假陽性結果。

2.檢測耗時長,操作繁瑣。

3.只能做定性檢測。

第二代熒光定量PCR

熒光定量PCR(Real-Time PCR),也叫做qPCR,通過在反應體系中加入能夠指示反映進程的熒光探針,通過熒光信號的積累來監測擴增產物的積累,通過熒光曲線來判斷結果,并可以借助Cq 值和標準曲線來定量。

qPCR 技術由于操作過程在封閉體系中進行,降低了污染概率,并且可以通過對熒光信號監測從而進行定量檢測,因此臨床應用最為廣泛,已成為PCR中的主導技術。

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為:TaqMan熒光探針、分子信標和熒光染料。

1)TaqMan熒光探針:

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。

探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

2)SYBR熒光染料:

在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后,發射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應是否特異。

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3)分子信標

是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補配對,導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近,不會產生熒光。

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PCR產物生成后,退火過程中,分子信標中間部分與特定DNA序列配對,熒光基因與淬滅基因分離產生熒光。

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第二代PCR主要缺點:

1.靈敏度還有欠缺,低拷貝標本檢測不準確。

2.存在背景值影響,結果易受干擾。

3.當反應體系中有PCR抑制物時,檢測結果易受干擾。

第三代數字PCR

數字PCR(DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR)通過終點檢測計算目標序列的拷貝數,無需采用內參和標準曲線即可進行精確的絕對定量檢測。

數字PCR采用終點檢測,不依賴于Ct值(循環閾值),所以數字PCR反應受擴增效率的影響降低,對PCR反應抑制物的耐受能力提高,具有很高的準確度和重現性。

由于具備高靈敏度、高精確度的特點,不易被PCR反應抑制劑干擾,無需標準品可實現真正意義的絕對定量,而成為研究和應用熱點。

根據反應單元的不同形式,主要可分為微流體式、芯片式和微滴式三大類系統。

1)微流體數字PCR,Microfluidic digital PCR,mdPCR。

基于微流控技術,對DNA模板進行分液,微流控技術能實現樣品納升級或更小液滴的生成,但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應體系結合,mdPCR已逐漸被其他方式取代。

2)微滴數字PCR,Droplet-based digital PCR,ddPCR。

利用油包水微滴生成技術對樣品進行微滴化處理,將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴,其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子,或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。

3)芯片數字PCR,Chip-baseddigital PCR,cdPCR。

利用集成流體通路技術在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體,通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動,將樣本液體分成大小一致的納升級于反應孔種進行數字PCR反應,實現絕對定量。

以法國Stilla technologies 公司的cdPCR技術為例,主要包括以下步驟:

第一,加樣和生成微滴:將樣本和PCR反應液加入微流控芯片,放入儀器中,儀器可通過物理方法生成單層平鋪的20000~30000個微滴陣列。

第二,對每個微滴進行PCR擴增:在Naica Geode微滴生成擴增系統自動進行PCR擴增。

第三,讀取和分析結果:將芯片置于Prism微滴讀取分析系統上進行熒光信號采集,計數陰陽性微滴,通過泊松分布計算獲得靶標基因絕對拷貝數濃度。

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總結一下,將樣本和PCR反應液加入微流控芯片,放入儀器中,通過物理方法生成單層平鋪的微滴陣列,隨后對每個微滴進行擴增,然后進行六通道熒光信號采集,計數陰陽性微滴,通過泊松分布計算獲得靶標基因絕對拷貝數濃度。

第三代PCR主要缺點:

1.儀器和試劑昂貴。

2.模板質量要求較高,模板量超過微體系量將導致無法定量,過少則定量準確度降低。

3.當存在非特異性擴增時也會產生假陽性。

PCR的各種延伸技術

1.遞減PCR(touchdown PCR):前幾循環溫度逐漸下降。

2.逆轉錄PCR(RT-PCR):以由mRNA逆轉錄而來的cDNA 為模板,也因為是從表現型基因來進行增量的,由此產生出來的cDNA 產物不帶有內含子(基因中不具意義的段落),常應用于分子克隆技術。

3.熱啟動PCR(hotstart PCR):以高熱激活型核酸聚合酶進行反應,減少非專一性產物。

4.巢式PCR(nested PCR):先用低特異性引物擴增幾個循環以增加模板數量,再用高特異性引物擴增。

5.多重PCR(multiplex PCR):在同一個管中使用多組引物。

6.復原條件PCR(reconditioning PCR):PCR 產物稀釋 10 倍后重新放入原濃度的引物和dNTP 等循環 3 次,以消除產物中的異二聚體。

7.dsRNA 合成(dsRNA replicator):合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase;從雙股 DNA轉錄為對應的雙股RNA(dsRNA)?蓱糜赗NAi實驗操作。

8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR 應用技術。

中篇:核酸等溫擴增技術 

PCR是使用最為廣泛的核酸擴增技術,以其靈敏性、特異性得到廣泛應用,然而PCR需要反復的熱變性,無法擺脫依賴儀器設備的局限,從而限制了其在臨床現場檢測中的應用。

自20世紀90年代初,很多實驗室開始發展無需熱變性的恒溫擴增技術,現已開發出環介導等溫擴增技術、鏈替代等溫擴增技術、滾環等溫擴增技術、依賴核酸序列等溫擴增技術等技術。

環介導等溫擴增

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本榮研公司的Notomi等于2000年首先提出來的新的核酸擴增技術。

其擴增原理是基于DNA在65℃左右處于動態平衡狀態,任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時,另一條鏈就會解離,變成單鏈。

DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶,使鏈置換DNA的合成不停地自我循環。

先確定目標基因上的6個特異性區域F3、F2、F1、B1、B2、B3,然后依據這6 個特異性區域設計4條引物(如下圖):

正向內引物(forwardinner primer,FIP),由F1c 和F2 組成。

反向內引物(backwardinner primer,BIP),由B1c 和B2 組成,中間均以TTTT作為間隔。

外引物F3、B3 分別由目的基因上的F3、B3 區域組成。

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在LAMP 反應體系中,內引物的濃度幾倍于外引物的濃度。內引物先與模板鏈結合合成互補鏈,形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結合,形成DNA雙鏈,在BstDNA 聚合酶的作用下,釋放出由內引物合成的互補鏈,該互補鏈經過一系列反應最終形成具有啞鈴結構的DNA單鏈。

以啞鈴結構DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開口的過渡性莖環結構DNA,由內外引物引導過渡性莖環結構DNA不斷發生鏈置換延伸反應,最后形成具有多個莖環結構的長度不一的DNA混合物。

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環介導等溫擴增的優勢與不足

 LAMP 的優勢:

(1)擴增效率高,能夠在1h內有效的擴增1-10個拷貝的目的基因,擴增效率為普通PCR的10 倍-100 倍。

(2)反應時間短,特異性強,不需要特殊的設備。

LAMP 的不足:

(1)對引物的要求特別高。

(2)擴增產物不能用于克隆測序,只能用于判斷。

(3)由于其敏感性強,容易形成氣溶膠,造成假陽性,影響檢測結果。

鏈置換擴增

鏈置換擴增(strand displacement amplification,SDA)是美國學者Walker于1992年首次提出的一種基于酶促反應的DNA體外等溫擴增技術。

SDA 的基本系統包括一種限制性核酸內切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對引物、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統。

鏈置換擴增其原理是基于在靶DNA兩端帶有被化學修飾的限制性核酸內切酶識別序列,核酸內切酶在其識別位點將鏈DNA打開缺口,DNA聚合酶延伸缺口3’端并替換下一條DNA鏈。

被替換下來的DNA單鏈可與引物結合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復進行,使靶序列被高效擴增。

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鏈置換擴增技術的優勢與不足

SDA 的優點:

擴增效率高,反應時間短,特異性強,不需要特殊的設備。

SDA 的不足:

產物不均一,在SDA循環中總要產生一些單、雙鏈產物,用電泳法檢測時必然會出現拖尾現象。

滾環核酸擴增

滾環核酸擴增(rolling circle amplification, RCA)是通過借鑒病原生物體滾環復制DNA的方式而提出的,指在恒溫下以單鏈環狀DNA為模板,在特殊的DNA聚合酶(比如Phi29)的作用下,進行滾環式DNA合成,實現目標基因的擴增。

RCA可分為線性擴增與指數擴增兩種形式,線性RCA的效率可達到105倍,而指數RCA的效率可達到109倍。

簡單區分,如下圖,線性擴增a只用1條引物,指數擴增b則有2條引物。

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線性RCA 又稱為單引物RCA,一條引物結合到環狀DNA上,在DNA 聚合酶作用下被延伸,產物為單環長度數千倍的大量重復序列的線狀單鏈。

由于線性RCA的產物始終連接在起始引物上,所以信號易于固定是它的一大優勢。

指數RCA,也被稱作超分支擴增HRCA(Hyper branched RCA),在指數RCA中,一條引物擴增出RCA產物,第二條引物與RCA產物雜化并延伸,置換已經結合在RCA產物上的下游引物延伸鏈,反復進行延伸和置換,產生樹狀的RCA擴增產物。

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滾環核酸擴增的優勢與不足

RCA 的優勢:

靈敏度高,特異性好,易操作。

RCA 的不足:

信號檢測時的背景問題。在RCA反應過程中未成環的鎖式探針和未結合探針的模板DNA或者RNA 可能產生一些背景信號。

依賴核酸序列的擴增技術

依賴核酸序列的擴增技術(nucleicacid sequence-based amplification, NASBA)是在PCR基礎上發展起來的一種新技術,是由1對帶有T7啟動子序列的引物引導的連續、等溫的核酸擴增技術,可以在2h左右將模板RNA擴增約109倍,比常規PCR法高1000倍,不需特殊的儀器。

 該技術一出現就被用于疾病的快速診斷,目前有不少公司的RNA檢測試劑盒都用此方法。

盡管RNA的擴增也可以使用反轉錄PCR技術,NASBA相比則有自己的優勢:可以在相對恒溫的條件下進行,相對傳統的PCR技術更為穩定、準確。

反應在41攝氏度下,需要AMV(avian myeloblastosis virus)逆轉錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一對引物來完成。

其過程主要包括:

1.正向引物包含T7啟動子互補序列,反應過程中正向引物與RNA鏈結合,由AMV酶催化形成DNA-RNA雙鏈。

2.RNA酶H消化雜交雙鏈中的RNA,保留DNA單鏈。

3.在反向引物與AMV酶的作用下形成含有T7啟動子序列的DNA雙鏈。

4.在T7 RNA聚合酶的作用下完成轉錄過程,產生大量目的RNA。

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NASBA的優勢:

(1)它的引物上帶有T7啟動子序列,而外來雙鏈DNA無T7啟動子序列,不可能被擴增,因此該技術具有較高的特異性和靈敏度。

(2)NASBA將反轉錄過程直接合并到擴增反應中,縮短了反應時間。

NASBA的劣勢:

(1)反應成分比較復雜。

(2)需要3種酶使得反應成本較高。

多酶恒溫快速擴增技術

多酶恒溫快速擴增(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification , MIRA)技術,多酶恒溫核酸快速擴增技術是一種模擬生物體內正常核酸擴增過程,在37℃條件下依靠多種功能蛋白協同作用下實現核酸的快速擴增。

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  1、MIRA試劑中的功能蛋白篩選了來源不同的各種酶,并且對某些酶進行了定點改造與修飾,使其核心功能酶體系效率更高同時體系更加完整。

     2、抗干擾能力和穩定性。MIRA試劑對整個體系與輔因子的種類與濃度進行了一系列的篩選和凍干生產工藝上多方面優化,使其抗干擾能力與穩定性更強;

     3、多樣化和個性化。得益于所有的功能蛋白自主生產和對該技術理論的深入了解,可以使mira技術在應用上實現多樣化?梢蕴峁┎煌w系的試劑等,還可以根據客戶的需求實現個性化的定制服務。

     4.具有自主專利,不擔心在后期成品研發中觸及專利違規情況。100%國產技術,在今后國內乃至國際市場的競爭中具有顯著優勢。

     5. 已建立完整的生產Protocol?梢苑定的大批量生產。

下篇:測序技術

本篇作為分子診斷技術全解析的最后一篇,介紹一下測序技術。

基因測序技術始于1977年,sanger發明的DNA雙脫氧末端終止測序法拉開了序幕。Sanger在1958年和1980年因為胰島素測序和DNA測序而兩度獲得諾貝爾化學獎,是第四位兩度獲得諾貝爾獎以及唯一獲得兩次諾貝爾化學獎的人。

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Sanger測序

Sanger測序采用四個雙脫氧核糖核酸(ddNTP)加入到正在合成的鏈上,由于雙脫氧核糖核酸少了一個氧原子,一旦被加入到DNA鏈上,反應即終止。

通過構建四個反應體系,加入AGCT四種雙脫氧核糖核酸,同時調節脫氧核糖核酸(dNTP)和ddNTP的相對濃度,可以使反應擴增得到幾百至上千堿基的終止產物。

隨后通過凝膠電泳對產物進行分離,分為四個泳道,每個泳道對應一種堿基,然后讀取條帶顯影結果。

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該方法因準確率高,被稱為基因檢測的金標準,但是耗時長,成本高。

2001年人類基因組計劃就是采用sanger測序完成的,從1990年人類基因組計劃建立開始,全球的科學家歷時11年耗資30億美元完成。

進入21世紀后,隨著物理及化學技術的發展,開始采用相同激發波長但不同發射波長的熒光集團來標記ddNTP,ATGC對應不同的熒光基團產生不同顏色的光被計算機讀取,測序的速度和效率大大提高。

二代測序

第二代測序技術也稱高通量測序(high-throughput sequencing,HTS)技術,相對于一代測序,它可以實現大規模平行測序,基本原理是將基因組分割成短片段,對短片段測序再進行拼接。

對比第一代測序技術擁有著高通量、低成本等優勢,目前相同數據量的檢測,其成本約為一代測序技術的0.01%,極大地推動了測序技術在臨床檢測方面的應用。

2005年454公司基于焦磷酸測序法推出了Genome Sequencer 20 System(GS 20)系統,開啟了高通量測序的進程。2007年,羅氏公司收購了454,并推出了一系列性能更優的NGS系統,極大的提升測序通量和準確性。

盡管具有讀長優勢,但是測序通量和成本始終限制了454平臺的推廣,同樣數據量下成本約是illumina的100倍,因此羅氏在2016年底終止了454NGS測序相關的業務。

2006年Solexa公司推出了Genome Analyzer系統,包括DNA簇、橋式PCR和可逆阻斷等技術,這使得GA系統在高通量、低成本、應用范圍廣等方面具有明顯優點。2007年,Illumina公司收購了Solexa并發布二代測序儀。

二代測序經過這些年的發展已經步入成熟期,目前市場上根據測序技術可以可以把二代測序平臺分為4類:邊合成邊測序法(Illumina)、半導體測序法(ThermoFisher)、聯合探針錨定聚合測序法(華大智造)和焦磷酸測序法。

Illumina邊合成邊測序

Illumina測序的流程主要包括樣品制備,簇生成,測序,數據分析。

首先是樣本制備和建庫

用DNA或RNA抽提試劑盒提取核酸,然后用超聲波將其隨即打斷成90-250bp左右的長度或者控制全部DNA在一定長度范圍內。

為了后續的擴增和測序,需要在這些DNA片段加入特定的序列。如下圖,分別是與流動池引物互補結合的區域(P5、P7)、與Read 1和read 2測序引物結合的區域(Rd1SP,Rd2 SP)以及標簽序列區域Index。

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添加完接頭序列的DNA合集稱為DNA文庫,這樣就完成了建庫,該步驟可以采用商業化的文庫制備試劑盒完成。

第二步是成簇Cluster Generation。

成簇是上述DNA片段被擴增的過程,該過程在流動池(Flow cell) 中完成。流動池是一種含有8個通道的厚玻璃片,每條通道中都隨即植入了能與文庫接頭P5或P7互補結合的短DNA片段。

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首先引物和流動池的固定DNA片段互補配對,固定在通道表面,然后在DNA聚合酶作用下DNA鏈進行互補延伸形成DNA雙鏈。通過變性,其中的單鏈被洗脫,剩下的一條單鏈會與旁邊的固定接頭鏈接,形成單鏈橋。

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同樣的,單鏈橋在DNA聚合酶作用下延伸配對形成雙鏈橋,通過變性形成2條單鏈,這兩條單鏈又分別與旁邊的固定引物結合,形成2個單鏈橋。重復這個循環,最終形成數百萬的DNA簇。

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上述過程所有的DNA片段都會被擴增,擴增結束后,反向連會被切斷洗脫,只留下正向鏈,為防止互補結合重新形成單鏈橋,3‘端被封鎖。

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第三步,測序。

首先,在流動池中加入熒光標記的dNTP和酶,由引物起始開始合成子鏈。由于dNTP存在 3’端疊氮基會阻礙子鏈延伸,因此每個循環只能測得一個堿基。合成完一個堿基后,洗掉多余的dNTP和酶,使用激光掃描獲得熒光信號。

隨后加入試劑將疊氮基團與熒光基團切除,然后流動池再通入熒光標記的dNTP和酶,由引物起始開始合成一個堿基。不斷重復這個過程,完成第一次讀取。

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所有的DNA片段的一個堿基會被同時讀取,在大規模并行的過程中,機器讀取的圖像類似下面這樣:

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同時,加入了不同的index來區分每個樣本及正負鏈。在完成第一次讀取后,復制出的鏈會被洗去,index片段引物被引入并與模板雜交,完成序列讀取后被洗去。這樣讀取到的序列與開始時已知的index比對后就可以給測得的序列貼上標簽,方便后續分析。

Paired-end測序已經是現在的主流,要完成雙末端測序,首先要將模板鏈3’去保護,模板折疊,index片段引入,在聚合酶參與下形成雙鏈橋,然后變性,恢復為單鏈,然后將正向鏈切除并洗去,留下反向鏈,與正向鏈類似,經過多個循環后完成讀取。

第四步,數據分析

測序完成后會產生數百萬個reads,基于在樣品準備時構建的index 分類來自不同樣本的序列。對于每個樣品來說,具有相似延伸的堿基被聚在一起。正向和反向read配對生成連續序列。這些序列通過與參考基因組匹配后,實現完整序列的構建。

二代測序的出現極大地解決了通量問題,在大幅提高測序速度和準確性的同時大大降低了測序成本,但閱讀長度相對較短。而以單分子測序為主要特征的三代測序,正朝著單分子、長讀長、低成本、小型化的方向發展,實現了測序領域的又一次變革。


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